Manoma, kad pirmoji medinė cerkvė šioje vietoje pastatyta apie XIV a. vid. Algirdo antrosios žmonos Julijonos iniciatyva. Mūrinę cerkvę 1514 m. pastatydino Konstantinas Ostrogiškis pergalei Oršos mūšyje pažymėti. Tam jis gavo Žygimanto Senojo privilegiją, mat tuo metu statyti mūrines cerkves Vilniuje buvo draudžiama. Naujoji cerkvė buvo pastatyta ant senosios cerkvės pamatų. Ji buvo nedidelė, bizantiškosios gotikos stiliaus, su trikampiu frontonu fasade ir nedideliu bokštu. 1609 m. cerkvė atiteko unitams. Po 1747 ir 1748 m. gaisrų rekonstruota įgijo barokinę išvaizdą. Iki XIX a. vidurio prieš cerkvę stovėjo ją nuo gatvės užstojęs namas. 1865 m. generalgubernatoriaus Muravjovo nurodymu aplinkiniai statiniai nugriauti, o cerkvė perstatyta pagal architekto Aleksandro Rezanovo projektą, darbams vadovavo Nikolajus Čiaginas. Išsaugotos senosios gotiškos sienos, beveik nepakitęs tūris, buvę barokiniai fasadai perdirbti neobizantine maniera. Palei cerkvę esantis praėjimas tarp namų iki Bokšto gatvės anksčiau vadintas Nikolajaus skersgatviu. XIX a. pab. cerkvėje šventiku tarnavo Joanas Šverubovičius – žymaus rusų aktoriaus Vasilijaus Kačialovo tėvas. Pats Vasilijus Kačialovas 1875 m. gimė Vilniuje ir iki 1893 m. gyveno greta cerkvės esančiame name (dabar – Didžioji g. 14).